Per prevenir la contaminació creuada durant l'operació, els requisits principals per al seu disseny, construcció i gestió de les operacions són:
1. Disseny i construcció de laboratori, sistema de treball segur o procediments operatius estàndard de seguretat hauran de complir els requisits de la quota vigent de GG; Requisits generals de laboratori de bioseguretat" GB19489.
2. La PCR es divideix en quatre àrees funcionals segons les etapes de treball, és a dir, l’emmagatzematge i l’àrea de preparació de reactius, l’àrea de preparació de mostres, l’àrea d’amplificació i l’àrea d’anàlisi del producte d’amplificació. Si es disposa d’un instrument de PCR fluorescent en temps real, es poden combinar les àrees d’amplificació i anàlisi del producte. Cal marcar clarament cada àrea funcional i no s’han de barrejar equips i articles de diferents àrees funcionals.
La direcció del flux d’aire del laboratori de PCR es pot realitzar d’acord amb l’àrea d’emmagatzematge i preparació de reactius → àrea de preparació de mostres → àrea d’amplificació → àrea d’anàlisi de producte amplificada per evitar que els productes amplificats entrin a la zona preamplificada juntament amb el flux d’aire. Es pot dur a terme de la manera de disminuir la pressió de l'aire des de l'àrea d'emmagatzematge i preparació de reactius → àrea de preparació de la mostra → àrea d'amplificació → àrea d'anàlisi del producte d'amplificació. Es pot aconseguir instal·lant ventiladors d’escapament, dispositius d’escapament a pressió negativa o altres mètodes factibles.
3. L’entrada a cada àrea de treball ha de seguir estrictament una sola direcció, és a dir, l’emmagatzematge i l’àrea de preparació dels reactius → l’àrea de preparació de la mostra → l’àrea d’amplificació → l’àrea d’anàlisi del producte d’amplificació. S'han d'utilitzar diferents àrees de treball (com ara colors diferents). Els treballadors no treuen roba de treball quan surtin de cada àrea de treball.
4. La neteja del laboratori s'ha de dur a terme cap a la zona de preparació i emmagatzematge dels reactius → àrea de preparació de la mostra → àrea d'amplificació → àrea d'anàlisi del producte amplificada. Diferents zones experimentals haurien de tenir els seus propis aparells de neteja per evitar la contaminació creuada.
5. Un cop acabada la feina, netejar immediatament la zona de treball. La superfície del banc de laboratori a la zona de treball ha de ser capaç de suportar els efectes de desinfecció i neteja de productes químics, com ara l’hipoclorit de sodi. La irradiació ultraviolada a la superfície del banc del laboratori ha de ser convenient i eficaç. Atès que la distància i l’energia de la irradiació ultraviolada són molt crítics amb l’efecte descontaminació, es pot utilitzar una làmpada ultravioleta mòbil (longitud d’ona de 254 nm) i, un cop finalitzat el treball, es pot ajustar per irradiar entre 60 i 90 cm a la taula experimental. . Com que el producte amplificat és només d’uns pocs centenars o desenes de parells de bases (bp), no és sensible als danys UV, per la qual cosa el fragment amplificat irradiat per UV s’ha d’irradiar durant més temps, preferiblement durant la nit.
Les funcions de l’àrea d’emmagatzematge i preparació dels reactius són: la preparació de reactius d’emmagatzematge, la distribució de reactius i la preparació de la barreja de reacció d’amplificació, així com l’emmagatzematge i la preparació de consumibles com ara tubs de centrifuga i puntes. Materials com els reactius d’emmagatzematge i els consumibles utilitzats per a la preparació de la mostra, s’han de transportar directament a l’àrea d’emmagatzematge i preparació del reactiu i no poden passar per la zona de detecció d’amplificació. Els materials de control positiu i materials de control de qualitat del kit no s’han d’emmagatzemar en aquesta zona, sinó que s’han d’emmagatzemar en aquesta zona. Àrea de processament de mostres.
La funció de l’àrea de preparació de la mostra és: extreure, emmagatzemar i afegir al tub de reacció d’amplificació l’àcid nucleic (ARN, ADN). Per a operacions amb mostres clíniques, s’han de complir els requisits d’equips de protecció, protecció personal i especificacions d’operació per a laboratoris secundaris de bioseguretat. Com que es pot produir contaminació per aerosols durant la barreja de mostres i la purificació d’àcids nucleics, es poden establir condicions de pressió positives en aquesta zona per evitar la contaminació per aerosols de les zones veïnes. Per evitar la contaminació creuada entre les mostres, després d’afegir l’àcid nucleic a provar, s’ha de tapar el tub de reacció que conté la barreja de reacció. Per a materials potencialment infecciosos, la tapa s’ha d’obrir a l’armari de seguretat biològica i hi ha d’haver procediments clars de manipulació i inactivació de mostres.
La funció de la zona d’amplificació és: síntesi d’ADN, amplificació i detecció d’ADN. Per tal d’evitar la contaminació causada pels aerosols, cal caminar a la zona. Cal tenir en compte que no s’han d’obrir tots els tubs de reacció provats en aquesta zona.
La funció de l’àrea d’anàlisi del producte amplificat és: més anàlisis i determinació de fragments amplificats, com ara hibridació, electroforesi en digestió enzimàtica, anàlisi de líquids de rendiment alt, seqüenciació, etc. en membranes o en microplaques o fitxes (etiquetatge de radionúclids o etiquetatge de nuclids no radioactius), electroforesi en gel d'agarosa directa o digerida, electroforesi en gel de poliacrilamida, transferència sud, mètodes de seqüenciació d'àcids nucleics, espectrometria de masses, etc.
L’àrea d’anàlisi del producte d’amplificació és la principal font de contaminació del producte d’amplificació al laboratori de PCR, per la qual cosa s’ha de tenir cura d’evitar que el producte d’amplificació es faci fora pels articles i la roba de treball d’aquesta zona. Quan es fa servir el mètode PCR-ELISA per detectar productes amplificats, s’ha de fer servir una rentadora de plaques per rentar les plaques i el líquid de residus s’ha de recollir en 1 mol / L de HCl i no es pot abocar al laboratori, però s’ha de descartar. del laboratori de PCR. Tirar. La punta usada també s’ha de remullar amb 1 mol / L de HCl i després posar-la en una bossa d’escombraries per a la seva eliminació segons procediments, com ara la incineració. Com que aquesta zona pot utilitzar determinades mutacions genètiques i substàncies tòxiques com ara el bromur d’etid, l’acrilamida, el formaldehid o els radionucleids, etc., cal tenir en compte la protecció de seguretat dels experimentadors.